В окулярах препарат выглядит ярким и чётким, а снимок получается желтоватым, с тёмными углами и грязными пятнами. Знакомая ситуация для каждого, кто впервые подключил камеру. Дело обычно не в самой камере: её настройки по умолчанию рассчитаны на среднюю сцену, а не на конкретный прибор и препарат.
Несколько настроек, выполненных в правильном порядке, приводят снимок в соответствие с тем, что видит глаз. Пройдём по ним от подготовки оптики до сохранения файла.
Сначала оптика, потом камера
Камера честно фиксирует всё, что даёт микроскоп, включая ошибки настройки. Поэтому перед съёмкой проверяют освещение по Кёлеру: полевая диафрагма раскрыта чуть шире поля зрения, конденсор сфокусирован, апертурная диафрагма прикрыта примерно на треть. Объектив, покровное стекло и окно камеры должны быть чистыми.
Пылинки на сенсоре и защитном стекле камеры видны на снимке как тёмные пятна, которые не двигаются при перемещении препарата. Пыль на конденсоре и осветителе тоже оставляет пятна на снимке. Проще удалить её до съёмки, чем потом ретушировать каждый кадр.
Яркость осветителя и экспозиция
Количество света на сенсоре регулируют двумя способами: яркостью осветителя и временем экспозиции. У галогенной лампы при убавлении напряжения свет желтеет, поэтому её выставляют на рабочий уровень и больше не трогают, а яркость снижают нейтральными фильтрами. Светодиод цвет при регулировке почти не меняет, и с ним проще.
Экспозицию подбирают так, чтобы фон был светлым, но не выбеленным. Ориентируются на гистограмму в программе: правый край распределения должен подходить к границе, не упираясь в неё. Пересвеченные участки теряют информацию безвозвратно, а слишком тёмный кадр после осветления становится шумным.
Усиление сигнала держат на минимуме. Его повышают, только когда света не хватает, а удлинять выдержку нельзя, например при съёмке подвижных объектов.
Баланс белого
Глаз подстраивается под цвет освещения и воспринимает пустой фон белым. Камера этого не делает сама, и без настройки фон получает жёлтый или голубой оттенок, а вместе с ним искажаются цвета окраски.
Баланс белого выставляют по пустому участку препарата. Отводят стекло туда, где под покровным стеклом нет ткани, и нажимают в программе кнопку установки баланса по области. После этого фон становится нейтральным. Процедуру повторяют при смене объектива, яркости галогенной лампы или фильтров.
Автоматический баланс при съёмке препаратов лучше отключить. Он пересчитывает цвет по каждому кадру, и срез, занимающий всё поле, сдвигает оттенки в сторону, противоположную окраске.
Коррекция неравномерности фона
Даже при хорошей настройке центр кадра обычно чуть ярче краёв. На одиночном снимке это едва заметно, но при сшивке панорам проявляется клетчатым узором, а при измерении яркости даёт ошибку. Исправляют это коррекцией плоского поля.
Делают снимок пустого участка при тех же настройках, и программа делит на него каждый следующий кадр. Заодно ослабляются пятна от пыли на оптике. Опорный снимок нужен свой для каждого объектива, и его обновляют после любой перенастройки света.
Резкость на экране и в окулярах
Камера и окуляры должны быть сфокусированы на одну плоскость. Если снимки стабильно получаются менее резкими, чем изображение в окулярах, проверьте подстройку адаптера камеры и диоптрийные кольца окуляров. Наводить резкость для съёмки надёжнее по экрану с увеличением фрагмента: глаз способен подстраиваться и прощает небольшую расфокусировку, сенсор её фиксирует.
На больших увеличениях смазать кадр может вибрация: шаги по комнате, работающая центрифуга, нажатие на клавишу. Съёмку запускают с небольшой задержкой или программно, не касаясь прибора.
Разрешение, формат и масштаб
Для документов и архива снимают в полном разрешении сенсора. Режимы с объединением пикселей применяют для слабого света, когда важнее чувствительность.
Формат файла выбирают по назначению. Для измерений, анализа и публикаций сохраняют без потерь, обычно в TIFF. Сжатие JPEG уменьшает файл, но оставляет артефакты на границах и меняет значения яркости, поэтому годится для отчётов и переписки, а не для количественной работы. Исходный файл хранят нетронутым, а подписи и стрелки наносят на копию.
На каждый снимок ставят масштабную линейку. Программа рисует её автоматически, если для объектива выполнена калибровка по объект-микрометру. Без линейки или записи об объективе изображение через год превращается в картинку неизвестного масштаба.
Тёмный фон: флуоресценция и тёмное поле
Всё сказанное относится к светлому полю, где фон белый. При флуоресценции и в тёмном поле фон чёрный, а объекты занимают малую часть кадра. Автоматика пытается осветлить черноту, растягивает выдержку и пережигает сами объекты. В этих режимах экспозицию задают вручную по самому яркому участку сигнала.
Баланс белого здесь тоже не применяют: белого в кадре нет. Цветную камеру оставляют с настройкой, сделанной заранее в проходящем свете, а монохромной он не нужен вовсе. Опорный кадр для выравнивания получают по равномерно светящемуся тестовому стеклу.
Порядок действий перед серией снимков
- Включить осветитель и дать галогенной лампе прогреться несколько минут.
- Настроить освещение по Кёлеру для рабочего объектива.
- Навести резкость по экрану.
- Подобрать экспозицию по гистограмме на пустом участке.
- Установить баланс белого по тому же участку.
- Снять опорный кадр для коррекции фона.
- Вернуться на препарат и снимать, не меняя яркость и диафрагмы.
При переходе на другой объектив шаги со второго по шестой повторяют. Занимает это несколько минут и избавляет от долгих исправлений в графическом редакторе.
Что допустимо при обработке
Изменения, применённые ко всему кадру одинаково, считаются допустимыми: общая яркость, контраст, баланс цвета, обрезка. Локальная ретушь, удаление «лишних» объектов, склейка частей разных кадров без указания на это недопустимы в научных и диагностических изображениях. Журналы и контролирующие организации могут проверять такие вещи, а потеря доверия к снимкам обходится дороже сэкономленного времени.
Когда проблема всё же в оборудовании
Если после всех настроек цвета остаются неверными, фон шумит при хорошем свете, а поле на экране заметно меньше поля в окулярах, причина может быть в несогласованности камеры, адаптера и микроскопа. Камеру с маленьким сенсором ставят через понижающий адаптер, а для слабого света выбирают сенсор с крупным пикселем.
Проще всего избежать этих проблем, выбирая микроскоп с цифровой камерой как единый комплект. В компании Арстек специалисты помогут подобрать штатив, адаптер, камеру и программу, рассчитанные на совместную работу.